Евгений Самойлов родился 3 (16) апреля 1912 года в Санкт-Петербурге, в семье рабочего Путиловского завода Валериана Саввича и домохозяйки Анны Павловны Самойловых.

В 1921—1929 годах учился в Ленинградской средней школе № 68, в 1928—1929 — в Ленинградской частной художественной студии Н. Н. Ходотова. В 1930 году окончил актёрское отделение Ленинградского художественного политехникума.

В 1930—1934 годах — актёр Ленинградского «Театра актёрского мастерства» под руководством Л. С. Вивьена, в 1934—1938 — Государственного театра им. Вс. Мейерхольда (ГосТИМ) в Москве, в 1938—1939 — Киевской киностудии (ныне Киностудия имени А. Довженко), в 1939—1940 — Московского театра Комедии, в 1940—1967 — Театра Революции (с 1954 — Московский драматический театр им. Вл. Маяковского), с 1968 — Малого театра.

Во время войны, в 1941—1942 годах — актёр Тбилисской киностудии (ныне «Грузия-фильм»), в 1942—1943 — Ереванской киностудии (ныне «Арменфильм»)

В кино с 1936 года. Дебютной стала роль инструктора физкультуры Гриши в фильме «Случайная встреча».

Член КПСС с 1951 года.

Скончался в Москве 17 февраля 2006 года на 94-м году жизни. Похоронен на Ваганьковском кладбище.